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组织切片技术分解

  组织切片技术 ? 组织切片技术是组织学、胚胎学、生理学、 动物学等生物科学以及病理学、毒理学等 医学基础学科研究观察细胞、组织的生理、 病理形态变化的一种重要方法。 ? 将组织固定、脱水、包埋等手段处理后, 可以把组织切成极薄的片子,再用不同的 染色方法染色,显示细胞、组织的形态, 甚至细胞、组织内某些化学成分的变化。 因此,组织切片技术是一项研究工作的重 要技术。 组织石蜡包埋和切片技术 组织石蜡包埋和切片技术 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 一般步骤: 1 取材、固定 保存原有的形态结构 2 洗涤 洗脱固定剂 3 脱水 酒精脱水为透明做准备 4 透明 为透蜡包埋做准备 5 透蜡 为石蜡包埋做准备 6 包埋 为切片做准备 7 切片 一般6-10μm 8 贴片 9 染色 10 封片 冰冻切片技术 ? 冰冻切片的种类较多, 有低温恒冷箱冰冻切片法, 二氧化碳冰冻切片法, 甲醇循环制冷冰冻切片法等。 ? 一般步骤: ? 1 取材 ? 2 冷冻切片 ? 3 贴片 ? 4 酒精固定 ? 5 染色 ? 6 封片 其它制片技术 1. 整封法 小型材料如鸡胚、蛙胚,经固定、染色、 脱水、透明、封片,保存。 2. 涂片法 血液、精液、粪便等,经固定、染色、脱 水、透明、封片,保存。 3. 磨片法 牙齿、骨骼、介壳,磨片、封片。 4. 浸渍分离法 利用药品使细胞间质溶解,细胞分离, 取单细胞,染色、脱水、透明、封片,保存。 5. 撕碎法 材料固定或浸渍到一定程度后,在解剖 镜下撕开,取单个细胞或纤维染色、封片。 6. 压碎法 柔软的材料,玻片间压碎,染色、封片。 组织石蜡包埋和切片技术步骤 ? (一)材料的采集与分割 ? 采集材料应根据制片的目的和要求而定,材料要 有代表性,无病虫害或其它损伤,如要观察病理 解剖,则要取病斑、病症部位。采下的材料应立 即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割 固定(如有条件也可在试验地采集后进行分割固 定)。为使固定液能迅速的渗透材料,材料要进 行分割。分割时动作要迅速。分割块的大小,宜 小不宜大,一般不超过1cm3,分割后立即杀死固 定。 ? (二)杀死与固定 ? 杀死动物的方法很多,但不论哪种,都要 尽力避免动物产时间的陷于痛苦和濒于死 亡状态,以免使动物的组织细胞成分结构 发生变化,或引起病理假象。 ? 动物杀死后应立即取材固定,以免招致会 因失水变形或死后组织变化,组织自溶自 组织死亡后就会开始。 ? ? 1. 2. 3. 4. 固定,就是将新鲜的材料从个体上取下后立即投 入固定剂中,借助化学药品的作用使细胞、组织 的形态结构保存起来,不使其改变形态或变性。 固定的意义: 防止组织溶解和腐败 使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等成分沉积保存 下来,保持原有的结构与生活时相仿。 因沉淀及凝固的关系,使细胞内成分产生不同的 折射率,使的细胞结构变得清晰起来,而且容易 染色。 固定剂兼有硬化作用,增加组织硬度,便于后处 理。 固定剂的选择 ? 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 可用于固定剂的药品应符合下列条件: 具有很好的穿透性。 具有快速的渗透力。 不会改变组织形态结构。 使细胞内的成分凝固或沉淀。 增加细胞的媒染作用和染色力。 使组织适度硬化,易于切片。 有保存作用 常用固定剂的性质及使用 ? 固定剂有单纯固定剂和混合固定剂之分。 ? 单纯固定剂 ? 甲醛(福尔马林)溶液:市售的为40%甲 醛含量。使用时稀释为10%即可。 ? 特点:渗透力强,但在随后酒精脱水过程 中收缩很大;不能使蛋白及核蛋白沉淀, 对神经、髓鞘固定很好,可固定线粒体、 高尔基体。可保存组织。 ? 乙醇 95%,或100%。 ? 特点:可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白。 酒精固定的标本对核的染色不良,原因是 酒精固定的核蛋白易于溶于水。 ? 穿透速度快,硬化显著,放置过久会发脆, 组织收缩厉害。 ? 70%酒精可长期保存材料。 ? 乙酸 5% ? 特点:不能沉淀白蛋白,球蛋白,但能沉 淀核蛋白,所以染色质固定很好。 ? 穿透性很好,一般组织只需固定1小时。组 织不会硬化。 ? 缺点:组织易膨胀。 ? 苦味酸(picric acid)强酸 ? 特点:易溶于酒精、二甲苯、水,可沉淀 一切蛋白,成为不溶于水的蛋白结合体, 但对脂类无作用。 ? 穿透速度较慢,使组织收缩显著,一般不 单独使用。 ? 4%多聚甲醛溶液 ? 进行免疫组织化学方法研究时常选用该固定液。 动物灌注固定及后固定(动物器官经该液灌注后, 然后取材,再用该液浸泡2-24小时)也常选该固 定液固定。 ? 可用于培养细胞的固定。 ? 胚胎材料的固定。 ? 单独用多聚甲醛固定的细胞不能使抗体进入细胞 内,因此,标本固定后必须用非离子去污剂(tritonx 100)透化标本。 ? 4%多聚甲醛溶液(PFA)配制 ? 称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器 (烧杯或烧瓶)中,持续加热磁力搅拌至60-65℃, 使成乳白色悬液。用1.0mmol/L 的NaOH调PH至 7.0使呈清亮状(滴加),再加入约500 ml 2× PBS, 充分混匀(在冰浴或冷水浴中)。可再检 测一下PH,过滤后定容至1000ml,室温或4℃ (保存备用)。 ? 混合固定剂 ? Zenker氏液 ? 升汞(氯化汞,极毒)5.0g,重铬酸钾2.5g, 硫酸钠 1g,蒸馏水100ml ? 以上为储存液,储于棕色瓶中,用时取 95ml储存液,临时加入冰醋酸5ml。 ? 常用固定剂,固定时间12-36小时,流水冲 洗12小时,70%酒精保存(0.5%碘),脱 汞。 ? Bouin氏液 ? 苦味酸饱和水溶液(0.9-1.2%)75ml,甲 醛(37-40%)25ml,冰醋酸5ml ? 常用良好的固定剂,适用于一般组织。渗 透迅速,固定均匀,组织收缩少,可把一 般的细微结构显示出来,对苏木精及酸性 复红易于着色。 ? 固定12-24小时,固定后70%酒精洗涤,保 存。 ? 特别适用于睾丸活检组织的固定。 ? Carnoy氏液:100%酒精60ml,氯仿30ml, 冰醋酸10ml,混合后4℃保存备用。 ? 常用于细胞学,尤其适于固定染色体,中 心粒,固定有丝分裂期细胞。 ? 固定时间20-40分钟,大型材料一般不超过 3-4小时,小鼠睾丸固定30-50分钟。不能 固定太久,否则组织膨胀,硬化。 ? ? ? ? ? A.A.F固定液(改良液): 95%-100%酒精85ml,冰醋酸5ml,浓甲醛10ml。 F.A.A固定液 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 又称标准固定液,万能固定液。适用于一般根,茎, 叶,花药,子房组织切片.在植物形态解剖研究上应 用极广,此固定液最大优点是兼有保存剂作用,但 对染色体的观察效果较差。 ? ? ? ? ? (三)洗涤与脱水 洗涤,把固定剂从组织中洗脱。 酒精无需冲洗; 水溶性固定剂,用流水冲洗; 含铬酸或重铬酸钾的固定剂,必须流水冲洗,冲 洗时间与固定时间相同; ? 含苦味酸的固定剂,流水冲洗12小时; ? 含氯化汞的固定剂,70%酒精加碘脱汞;去汞后 用5%硫代硫酸钠去碘。 ? 脱水 是为了组织透蜡,但透蜡之前,要经 过二甲苯先行透入。 ? 可用的脱水剂: ? 乙醇 梯度酒精脱水是常用的方法。 ? 丙酮 脱水能力比酒精强,但对组织收缩较 大。 ? 正丁醇 脱水力弱,但对组织收缩少,可与 酒精混合脱水,能溶解石蜡,可不经透明 直接包埋。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? (四)透明 便于透蜡、包埋。 常用透明剂: 二甲苯 甲苯,可替代二甲苯,但透明较慢。内置 12-24小时组织也不变脆,故由于二甲苯。 苯 氯仿 香柏油 缺点是透明慢,不宜被石蜡替代。 松酯醇 适用于一些易碎的组织。可于二甲 苯1:4混合透蜡。 ? ? ? ? ? (五)透蜡及包埋 包埋蜡的熔点: 软蜡42-45℃,45-50 ℃, 硬蜡52-54 ℃,56-60 ℃ 要使石蜡硬度与组织硬度相近,组织较硬时用硬 蜡,反之用软蜡; ? 切片较薄时用软蜡(8μ m及以下); ? 室内温度很重要: ? 10-19 ℃选用52-54 ℃蜡,室温高时用56-58 ℃ 蜡。 ? 包埋用相应的石蜡。使用蜡杯或自制的蜡 纸盒包埋。 ? 先将一部分液化的石蜡加入杯/盒中,取透 蜡好的组织按方位放置与杯/盒,再加入一 些液化石蜡,用加热过的镊子在组织周围 游动两圈,消除组织周围形成的蜡膜,再 加一些液化石蜡,轻吹液化石蜡表面,待 出现蜡膜后倒置杯/盒于水中降温硬化。 ? ? ? ? ? ? (六)切片及贴片 使用切片机连续切片。厚度6-10μm。 注意切片机的使用。刀的选择。 毛笔的旋转方向。 贴片 把切片贴于干净的载玻片上。 可购买多聚赖氨酸载玻片,也可以自制蛋 白液,用时涂于洁净的载玻片上。滴加一 些蒸馏水,将切片放置于蒸馏水上。加温, 展片,去水,晾干,保存。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? (七)染色及封片 染色剂: 普通组织染色剂 苏木精,伊红,(HE染色法); 碱性染料 结晶紫、亚甲蓝、天青 酸性染料 伊红。 结缔组织染色剂 Mallory三色染色法:苯胺蓝、橘黄G、酸性复红。 神经组织染色剂:银染 银盐沉淀。 ? ? ? ? ? ? ? ? 染料的性质 发色团 助色团 染料的分类 根据化学反应分为三类: 碱性、中性、酸性 根据染色对象分类: 核、胞质、脂肪染料。 石蜡包埋及切片、染色、封片流程 ? 1 取材、固定 ( Bouin氏液) 0.5X0.5X0.2 12-24h ? 2 洗涤 12h ? 3 脱水 ? 70%酒精 45-60min ? 80%酒精 45-60min ? 95%酒精 45-60min ? 100%酒精 30-45min ? 1:1酒精:二甲苯 20-30min ? ? ? ? ? ? ? 4 透明 二甲苯 15-20min 5 透蜡 二甲苯:石蜡1:1 20-30min 蜡1,2,3 各20-30min 6 包埋 7 切片 一般6-10μm 8 贴片 37℃过夜干燥 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 9 染色 二甲苯脱蜡1,2 各3-5min 二甲苯:酒精 1:1 3-5min 100%酒精 1-2min 95%酒精 1-2min 80%酒精 1-2min 50%酒精(可省略) 1-2min 碘酒精脱汞(只用于升汞固定材料)3-5min 蒸馏水 1-3min ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 苏木精染色 自来水冲洗(碱性水) 酸水分化 自来水冲洗 70%酒精 80%酒精 伊红复染 90%酒精分色 95%酒精1,2 100%酒精1,2 二甲苯1,2 10 封片 10-15min 3-5min 3-5s 3-5min或更长 1-2min 1-2min 3-5min 2-5s 1-2min 1-2min 1-2min

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